Dota 2 представляет собой многопользовательскую игру в жанре MOBA («многопользовательская онлайновая боевая арена»), в которой сражаются две команды по пять игроков. В игре участвуют две команды по пять человек. Одна команда играет за светлую сторону (англ. The Radiant), другая — за тёмную (англ. The Dire). Конечная цель каждого матча — уничтожить вражескую «крепость» (англ. Ancient), особый объект, принадлежащий противнику, и защитить собственную крепость. Подобно Defense of the Ancients, Dota 2 использует управление с помощью мыши и клавиатуры, схожее с управлением в стратегиях в реальном времени, и вид с расстояния, имитирующий изометрическую проекцию.

Каждый из десяти участников матча управляет одним персонажем, который называется героем; игроки выбирают героев из обширного списка, и каждый герой имеет свою узнаваемую внешность, силы и слабости. В ходе матча игрок выполняет определённую роль, как, например, «керри» (англ. Carry) или «саппорт» (англ. Support), и герои могут по своим характеристикам лучше подходить для той или иной роли. В течение матча герой может получать очки опыта, зарабатывать золото, покупать и собирать предметы, которые усиливают его или дают дополнительные способности.

«Керри» в начале матча относительно слабы, но по мере набора очков опыта становятся сильнее и получают доступ к способностям, позволяющим им легко побеждать врагов и в конечном счёте добиться победы для всей команды. Способности «саппортов» позволяют оказывать помощь товарищам — например, восстанавливать потерянные очки здоровья. Если очки здоровья героя снижаются до нуля — например, его одолевает в бою вражеский герой — герой в течение некоторого короткого времени считается «погибшим»; по окончании этого времени герой вновь появляется рядом с крепостью, и управляющий им игрок может возобновить игру. Уничтожение вражеского героя приносит его победителю большое количество очков опыта.

Каждый матч проходит на квадратной карте специального вида, где крепости обеих команд находятся в противоположных углах, а игроки рассредотачиваются по соединяющим эти крепости путям — «линиям» (англ. Lane). Помимо самих игроков, в игре принимают управляемые компьютером существа-«крипы» (англ. Creeps) и неподвижные строения-«башни» (англ. Towers), свои с каждой стороны; они также участвуют в сражении, атакуя вражеских героев, крипов и башни противника и тем самым помогая «своей» команде. Туман войны, покрывающий большую часть карты, не позволяет игрокам следить за передвижениями противника.